瓜尔胶降解菌诱变及甘露聚糖酶特性研究

发布日期:2015-01-26 21:02:02

紫外诱变

为了筛选降解瓜尔胶的菌株,从亚麻液中筛选到1株降解瓜尔胶产p-甘露聚糖酶的细菌HL-28,经形态观察、生理生化特性和 16S rDNA序列分析鉴定其为金黄杆菌菌株HL-28产甘露聚糖酶的活力达64.532 U/ml,经紫外诱变育种获得突变 株HL-28-30,酶活提高到339.787 U/ml,提高T 426.54%。紫外诱变粗酶发挥催化作用的最适PH值为5.6,最适反应温度50 t:。

瓜尔胶是一年生草本显科作物瓜尔豆 rc^ono/o6i«)种子中的胚乳多糖[1]。p-甘露聚糖酶能将瓜尔 胶、魔芋胶等可食性植物胶分解为低聚糖[2],此外,P-甘露聚 糖酶在医药和石油开采等领域得到广泛应用。甘露聚糖 酶存在于各种生物体中,比如细菌、丝状真菌和动植物中[3]。 微生物来源的P-甘露聚糖酶有活性好、来源稳定、作用温度 和pH范围广、容易提取等优点[4]。因此微生物来源的p-甘 露聚糖酶已成为国内外研究的重要方向。该研究首次从亚 麻液中筛选到1株降解瓜尔胶的产甘露聚糖酶的金黄杆 菌HL-28,通过紫外诱变育种提高了菌株产甘露聚糖酶的能 力,为P-甘露聚糖酶在食品、医药和石油工业中的广泛应用 奠定了基础。
1材料与方法 1.1材料
1.1.1亚麻样品。亚麻原茎由黑龙江省巴彦亚麻有限公司 提供。
1.1.2 主要培养基。富集培养基(g/L):瓜尔胶3.0、 KH2P04 0.5,PH 7.0;分离培养基(#L):瓜尔胶 3.0、KH2P04
1.0、MgSO4 • 7H20 1.0、]\札(:15.0、琼脂18.0、?117.0;初筛 培养基(g/L):瓜尔胶 3. 0、CaCl2 0_ 5、KH2P04 0_ 05、NaCl 0• 8、MgS04 • 7H2 0 0.025、KN03 0.7、酵母膏2.0、蛋白胨5.0、 琼月旨18.0、PH7.0;种子培养基(g/L):胰化蛋白胨10.0、酵母 提取物5_ 0、NaCl 10. 0、pH 7. 0;产酶培养基(g/L):瓜尔胶
3.0、CaCl2 0. 5、KH2P04 0.05、NaCl 0. 8、MgS04 • 7H20 0• 025、 KN03 0• 7、酵母膏 2.0、蛋白胨 5.0、PH 7.0。
1.2方法
1.2.1菌种的初筛。将亚麻原茎放入装水的烧杯中37 t
1.2.2粗酶液的制备。取种子液接种于发酵产酶培养基 中,发酵液经离心后上清液即为粗酶液。
1.2.3甘露聚糖酶活性的测定。采用改进的3,5-二硝基水 杨酸法(DNS方法)测定酶活力[5];利用比色法测定酶解后 还原产物的生成量,以表示酶的活力。酶活力定义:在一定 温度和pH下,以每分钟生成相当于1 pmol D-甘露糖所需酶 量为一个酶活力单位(IU)。
1.2.4菌株的鉴定。参照《伯杰细菌鉴定手册》[6]和东秀珠 等[7]方法对其进行形态特征、培养特征及生理生化测定等方 面的初步鉴定。
菌株采用CTAB法提取细菌总基因组DNA,利用通用引 物 27F: 5 '-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和 1492R: 5 '-TACG- GYTACCTTGTTACGACTT-3'进行 PCR 扩增。PCR 扩增条件: 94 t预变性3 min;94 T变性30 s,56丈退火30s,72丈延伸 1.5 min,共30个循环;72 T延伸10 min。PCR产物回收纯 化后与载体PMD18-T连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经 质粒PCR检测为阳性的菌液交于上海生工生物工程有限公 司测序。
1.2. S紫外诱变。挑取出发菌株接种于LB液体培养基中, 37 t培养约13 h。常温离心后用生理盐水洗涤菌体,调整菌 悬液中菌体浓度为l〇8cfu/ml。将制备好的菌悬液在紫外灯 下照射〇、1〇、15、2〇、25、30、35、40、45、5〇8,涂布于1^固体平 板培养基上,37丈倒置培养过夜,计算致死率。致死率= (对照菌液的活菌数-处理菌液的活菌数)/对照菌液的活菌 数。诱变后的菌株连续传代7次测酶活检验遗传稳定性。 1.2.6粗酶的酶学性质。
1.2.6.1pH值对酶活力的影响。以PH 2. 2 ~ 8.0的 N^HPO。一柠檬酸缓冲溶液配制瓜尔胶溶液,在45 t下反应 30 min测定酶活,以最高酶活为100% ,测量取3组平行,确 定酶反应最适pH值。
1.2.6.2pH值对酶稳定性的影响。将等量的酶液分别与 等体积不同缓冲液混合,于45 SC保温1 h后取样,测量其酶 活力。设定原酶液为对照组,其酶活力记为100%。计算各 pH条件下的相对酶活。测量取3组平行。
1.2.6.3温度对酶活力的影响。分别在30、40、45、50、55、 60、65和70尤下,在最适PH条件下测定酶活,以最高酶活为 100% ,测量取3组平行,确定最适反应温度。
1.2.6.4温度对酶稳定性的影响。将酶液分别于0、4、16、 28、37、40、55、65、75、85 下保温1 h后取样,测定酶活力。 设定原酶液对照组,其酶活力记为100%。计算各温度梯度 下的相对酶活。测量取3组平行。
2结果与分析
2.1菌株的筛选与鉴定该研究从亚麻液中分离并筛选到 降解瓜尔胶的产P-甘露聚糖酶的细菌HL-28,初筛水解圈直 径tf/C为5. 6,复筛采用DNS方法测定酶活力为64. 532 U/ml。该菌株的菌落呈圆形金黄色,边缘整齐,表面光滑不 透明,革兰氏染色阴性。该菌株的生理生化特性见表1。
表1菌株HL-28生理生化特性
特征菌株HL-28特征菌株HL-28
需氧产酸:海藻糖+
葡萄糖+木糖+
阿拉伯糖+七叶灵水解+
纤维二糖+吲哚产生-
乳糖+还原硝酸盐+
甘露醇+淀粉水解+
麦芽糖4-产生色素黄色到橙色
棉籽糖+37^0生长+
水杨苷—从海洋环境分得—
蔗糖
鼠李糖+从土或淡水里分得+
以菌株HL-28基因组DNA为模板扩增16S rDNA序列, 获得目的片段1 474 bp。该序列测序后提交至GenBank,获 得序列登录号KC979153。BLAST同源性比对结果显示,菌 株 HL-28 与C/wyseoftacferiiim(登录号为
AF531766)16S rDM序列同源性为99%。将菌株HL-28的 16S rDNA序列经BLAST比对后选取相似度较高的序列,利 用MEGA 4.0通过邻近法构建系统发育树,结果见图1。由 图1可看出,所筛选菌株与金黄杆菌亲缘关系最近。所以, 结合生理生化特性和16S rDNA序列分析结果,菌株HL-28 鉴定为 Flavobacteriaceae(黄杆菌科)C/tryseo6orterijim(金黄杆 菌属)。_ 
 
图1菌株HL-28以16SrDNA为基础构建的系统发育树 
2.2紫外诱变育种以HL-28为出发菌株进行紫外诱变, 诱变后的致死率结果如图2,根据诱变剂量选择原则,紫外诱 变致死率在70% ~80%时,正突变率最高。
初筛时选择比值大的菌株,///C比值大说明菌株 降解底物能力强;菌落直径大说明菌落适宜在该环境中生 长。初筛染色后选择20株正突变菌株进行复筛,最终得到 酶活最高的突变菌株为HL-28-30,酶活力为339. 787 U/ml, 是出发菌株酶活力(64. 532 U/ml)的5. 27倍,提高了 426.54% ,表明紫外诱变效果较好。HL-28-30的1 ~7代遗 传稳定性研究结果(图3)表明,该菌株遗传稳定性良好,可 用于后续研究。
2.3粗酶的酶学性质
HI pH值細|活力及織定性的影响。图4表明,当PH值在 2.7~5.6范围内时,酶活逐渐±升,PH值大于5.6时酶活逐渐下 降,可见酶促反应的最适pH值为5.6,过酸过碱均导致其酶活力降 低。此外,甘露聚麵在PW.8 ~6.3范围内锻賴定(图5),扯 述pH范围内仍保持80%的酶活。
2.3.2温度对酶活力及其稳定性的影响。由图6可看出, 酶最适反应温度为50当温度在30~50 t范围内,菌体
产酶的酶活随着温度的增长而缓慢上升,当温度大于50 T时酶活力急剧下降,分析原因可能是因为高温导致蛋白质变 性,从而使得酶活力大大减小。对于菌株产生甘露聚糖酶稳 定性的研究结果见图7。图7表明,该菌株在温度低于55 T 的条件下温浴1 h能稳定产生p-甘露聚糖酶D 3结论与讨论
来自于细菌的甘露聚糖酶已被分离得到,比如 图7温度对酶稳定性的彩响
KU-1、Sp/wVigomo/i〇5strain 等[8_9]。该研究首次报道 了细菌金黄杆菌HL-28对瓜尔胶较强的降解能力,并且胞外 分泌甘露聚糖酶,产生的甘露聚糖酶活性可达64.532 U/ml, 酶活明显高于赵意平[1°]等(34. 38 U/ml和21. 95 U/ml)、蒙 海林["]等(15.66 U/ml)所测得的甘露聚糖酶活力。李剑 芳、蒙海林和罗强等采用物理诱变方法提高了 P-甘露聚糖酶 活性1n-15]。该研究通过紫外诱变得到1株高产、稳产甘露 聚糖酶的突变株HL-28-30,其产p-甘露聚糖酶酶活提高到 339.787 U/ml,是出发菌株酶活力的5. 27倍。不同来源的 P-甘露聚糖酶性质差异很大,细菌中芽孢杆菌来源的甘露 聚糖酶的最适反应温度为50 ~70 T ,最适反应PH值为5.5 ~7.0,耐热性较强。该研究中金黄杆菌产P-甘露聚糖酶发 挥催化作用的最适pH为5.6,最适反应温度50 t,与来源于 芽孢杆菌的甘露聚糖酶性质相似。今后除了需要进一步 筛选活力更高、稳定性更好的菌种之外,还应结合基因工程 的方法构建新型高效表达的工程菌,以提高P-甘露聚糖酶的 活力和产量,使其达到实际应用的目的。
吸烟与健康是一个全社会普遍关注的问题,作为研究人 员,应从保护消费者身体健康的角度出发,开展减害降焦的 研究,弄清焦油的产生机制,并依据其机制制定出改善措施 以及研发更加先进的卷烟工业工艺,尽力在减少有害物质的 同时满足吸食者的吃味需求。
但随着减害降焦研究的进展,社会各界开始对“降焦减 害”提出质疑:低焦油是否意味着低危害?烟民实际吸人焦 油量是否与盒标焦油量正相关?焦油量的降低是否意味着 对人类的危害减少?客观来讲,把添加物放在烟丝中燃烧, 是否会产生新的有害物质,是否真的能起到减害的作用还值 得研究。作为研究人员,不能因为质疑而停止前进的步伐, 应该扎实推进各项研究工作,用详尽的数据进行科学论证, 为烟草减害降焦做出长足的贡献。
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