湿热复合改性对谷朊粉巯基双硫键的影响,蛋白质是由氨基酸聚合而成的大分子化合物，广泛存在于各种生物体中，它 是生命活动的物质基础。二硫键是一种共价键，它对蛋白质的空间折叠和高级结 构的形成与维持十分重要。二硫键的形成迫使同—肽链或不同肽链的不同区域的 氨基酸残基向一起靠拢聚合，由此肽链迅速折叠并形成稳定的空间拓扑结构，该 区域内的氨基酸残基数量是高度密集的；同时疏水氨基酸残基围绕着二硫键，可 形成局部疏水中心，拒绝水分子进入肽的内部破坏氢键，利于形成稳定的髙级结 构区域。由于二硫键可以桥接肽链的不同区域，有时候也被称为二硫桥（disulfide bridge) w’64]。巯基是半胱氨酸的残基，是所有蛋白质氨基酸残基中最活泼的集 团，蛋白质分子中两个半胱氨酸残基的巯基基团可以发生氧化反应形成二硫键， 二硫键虽然是共价键，但并不十分牢靠，很容易被还原而断裂，断裂后可以再次 氧化，重新形成二硫键。当二硫键被断开还原为巯基基团时，蛋白质结构必然发 生改变。因此，二硫键是动态变化的，只具有相对的稳定性，湿热复合改性对谷朊粉巯基双硫键的影响,这一特征与氦基酸 氮原子间形成的十分牢靠的共价键不同。
本试验研究了果胶、海藻酸钠、明胶、羧甲基纤维素钠和瓜尔胶在湿热条件 下对谷朊粉自由巯基和二硫键含量的影响。
5.2材料与方法 5.2.1试验材料与试剂
谷朊粉，果胶-谷朊粉复合物，CMC-谷朊粉复合物，海藻酸钠-谷朊粉复合物， 明胶-谷朊粉复合物，瓜尔胶-谷朊粉复合物分别按照第二章所述获得；EDTA二钠， Ellman试剂，尿素，三氯乙酸，巯基乙醇，Tris，甘氨酸。
5.2.2仪器
分光光度计，离心机，恒温水浴锅。
5.2.3试验方法
5.2.3.1自由巯基（"SH)含量的测定
首先按下列要求配置试剂：
(1)1'1^-^7缓冲液：精确称取1'1^10.418克，甘氨酸6.75克，£074二钠
1.48克，加蒸馏水定容至1000ml,调节pH到PH8。
(2) Tris-Gly-8MUrea 溶液：在 70mlTris-Gly 缓冲液中加入尿素 48.048 克，
定容至100ml。
(3)Ellman试剂(4mg/ml):称取400毫克5, 5-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)
溶于Tris~Gly缓冲液，并定容至100ml。
实验步骤如下：
吸取0.5ral溶度为15mg/ml的谷朊粉溶液加入试管，然后向试管中加入2. 5ml Tris-Gly-8MUrea溶液，再加入〇.〇2mlEllman试剂，迅速混匀后在25’C下保温反 应，30分钟后用分光光度计测定其在X=412nm处的吸光度值，空白值用蒸馏水代 替样品测定，每组三个重复，取平均值为最终结果。计算公式如下所示： umol SH/g=73.53XA4l2XD/C 公式中：A«2为人=412nm下吸光度值；
D为稀释系数；
C为样品的蛋白质最终浓度，单位为mg/mL。
5.2.3.2双硫键（S>S)含量的测定
首先配置好8mol/L脲试剂、12%的TCA试剂和4mg/ml的Ellman试剂，湿热复合改性对谷朊粉巯基双硫键的影响,然后 吸取0. 5ml溶度为15mg/ml的谷朊粉溶液加入10ml离心试管，接着加入〇. 〇5ml 巯基乙醇和2ml脲试剂，混匀后于25°C下保温1小时；之后加入5mlTCA试剂继 续于25，C下保温反应一小时；然后于5000r/min的速度下离心l〇min，除去上清 液，同法用5mlTCA洗涤沉淀两次，最后向沉淀中加入脲试剂5ml和Ellman试剂 0.05ml，5分钟后去上清液于处测吸光度值*空白组为5ml脲试剂，每组3个 平行，取平均值。计算公式如下：
umol(SH+还原的 SS) / g=73. 53XA«2XD / C. umol(S-S〉/g=(总巯基含量-游离巯基含量）/2
5.3结果与讨论
巯基和二硫键的含量与蛋白质的结构和功能有着非常密切的联系，巯基在氧 化条件下易形成双硫键，使蛋白质分子间发生交联从而形成髙分子量的聚合物[55]。 但这种双硫键并不牢固，很容易被还原而断裂，从而导致蛋白质构象的变化，使 蛋白质的功能特性发生改变。实验结果表明，经果胶改性的谷朊粉，其自由巯基 的含量与未处理的谷朊粉相比，增加了 50. 5%,而二硫键的含量却只有2.37mol/g， 降低了 94.64%;经海藻酸钠改性的谷朊粉，其自由巯基的含量与未处理的谷朊粉 相比，增加了 27.44%，二硫键的含量降低了 22.43%;经明胶改性的谷朊粉，其自 由巯基的含量与未处理的谷朊粉相比，增加了 18.51%,二硫键的含量降低了 36.34%;经羧甲基纤维素钠改性的谷朊粉，其自由巯基的含量与未处理的谷朊粉 相比，增加了 14.14%,二硫键的含量降低了 48.39%;经瓜尔胶改性的谷朊粉，其 自由巯基的含量与未处理的谷朊粉相比，增加了 29.46%，二二硫键的含量降低了 57.81%。总体来看，经胶体改性后的谷朊粉，其二硫键的含量均有所减少，表明 谷朊粉蛋白质分子间的交联减少，分子间的聚合程度降低，从而使蛋白质分子的 表面活性增强。从谷朊粉蛋白质功能性质方面来看，就是谷朊粉溶解性、乳化性、 起泡性等功能性质的提高。
还原成自由巯基，二硫键减少，蛋白质分子发生解离，分子量减小，湿热复合改性对谷朊粉巯基双硫键的影响,这可能是谷 朊粉改性后溶解性增大的原因所在。总的巯基含量的降低原因可能是巯基和胶体 的某些集团发生交联，使其不能被检测出来。
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5.4本章小结
通过对改性前后谷朊粉的自由巯基和二硫键含量的测定分析，除瓜尔胶外， 其他四种胶体对谷朊粉进行改性后，其自由巯基含量都有所增加，所有改性后的 谷朊粉的二硫键含量都有降低，其二硫键含量从大到小依次为：海藻酸钠-谷朊粉 复合物、明胶-谷朊粉复合物、羧甲基纤维素钠-谷朊粉复合物、瓜尔胶-谷朊粉复 合物、果胶-谷朊粉复合物。实验结果表明湿热条件下胶体对谷朊粉的改性使谷朊 粉中二硫键减少，蛋白质分子间的聚合度降低，蛋白质分子的表面活性增大，从 而使谷朊粉溶解性、乳化性、起泡性等功能性质都得到一定的改善。
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