由于半乳甘露低聚糖的最适温度为501C,故选择 50T作为最适酶解温度，以0.3%瓜尔胶为底物，以底 物的酶解率为指标，以加酶量（U • g^kpH值和酶解 时间为影响因素，进行L1S(43)3因素4水平正交实 验，通过极差分析和实验结果确定最佳酶解条件。
1.4半乳甘露低聚糖产率的测定
在最佳反应条件下进行酶解反应，反应完毕在沸 水中将酶灭活，酶解液过滤，移至超滤装置中，在0.2 MPa的压力下，使用截留分子量为1000 Da的超滤膜 截取分子量<1000 Da的寡糖。收集超滤透过液，浓 缩，冷冻，干燥，即得GMOS干粉，准确称取其质量。 按式(2)计算GMOS的产率。
产率祕 1.S酶解产物的表征
用时间飞行质谱(MALDI-TOF)鉴定酶解产物的 分子量和聚合度。质谱仪的氮激光器波长337 rnn，采 用延时引出（Delayed extraction)和反射（Ref lection ) 的工作方式，加速电压19. 5 kV，反射电压20 kV，延 时引出电压14. 5〜16.5 kV,延时时间50〜200 ns，正 离子检测。.
用核磁共振碳谱(13CNMR)对酶解产物进行结构 表征。并用高效液相色谱法（HPLC)检测酶解产物中 各组分的含量，色谱条件：色谱柱NH2 Column U16 mmX250 mm),柱温 30X：,流速 1 mL • min一】，进样 量为20 pL,流动相乙腈••水=75 : 25。根据GMOS 保留时间定性，色谱峰面积归一化法定量。
2结果与讨论
2.1正交实验结果与分析
按照L1S(43)设计正交实验方案，测定了不同条件 下瓜尔胶的酶解率，结果见表1。
从表1的极差分析可以看出，各因素对瓜尔胶酶 解率的影响大小依次为:pH值>加酶量>酶解时间。 最佳酶解条件为：pH值7.0、酶解时间10 h、加酶量 40 U . g-1。
2.2半乳甘露低聚糖的产率测定
在上述最佳酶解条件下，对1000 mL 0. 3%瓜尔 胶液进行酶解反应，酶解液通过截留分子量1000 Da 的超滤膜，透过液经浓缩，冻干，得到GMOS干粉
1.27 g。按式(2)计算，GMOS的产率为42. 3%»
2.3半乳甘露低聚糖的结构表征
2.3.1 MALDI-TOF 分析
片甘露聚糖酶酶解产品（未经超滤）的MALDI- TOF谱图见图1。
50010001500200025003000
mfz
图1半乳甘露低聚糖的时间飞行质进图 Flg.1 The MALDI-TOF spectrnm of GMOS
由图1可看出，质谱峰的质核比分别是527. 5、 689. 5、851. 6、1013. 7、1175.8、1337. 8、1499.9、 1662. 0、1824. 0、1986. 1、2149. 1，一共 11 个峰。
在GMOS分子中，每个结构单元是一个单糖（甘 露糖或半乳糖)残基，其质量数是162,因此，质谱峰的 荷质比(m/z)可表示为:m/z=18 + 162X« + Na+,其 中《表示单糖数目、Na+是与低聚糖结合的钠离子。 由于设备的最小量程是500 wt/z，所以图谱中没有单 糖和双糖的分子离子峰，该图的质谱峰值从527. 5开 始。各峰之间相差162,与已知单元是一个单糖（甘露 糖或半乳糖)残基相符合。从第一个峰（527. 5)开始， 其聚合度为3(三糖），此后每个峰递增1个聚合度，直 至最后的质谱峰(2149.1)为十三糖。
2. 3. 2 13CNMR 分析
GMOS的13CNMR谱图如图2所示。
为了区别不同类型的碳，其中甘露糖基用man表 示，半乳糖基用gal表示，图2中各种碳的化学位移如
ppm信号峰外（带OH的C),还有一个69.417 ppm 的信号峰，这是C6通过糖苷键与支链上的半乳糖相连 后，其化学位移向低场移动的结果。
(3)降解产物的Q-man除了出现一个75.658 ppm信号峰外（带OH的C),还有一组79. 429 ppm、 79. 300 ppm、79. 063 ppm的信号峰，这是甘露糖基C4 通过糖苷键与甘露糖相连后，受支链上半乳糖的空间 结构影响，其化学位移向低场移动的结果。
甘露糖、甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖标准品的 保留时间分别为 5. 225 min、6. 822 min、8. 102 min、 9. 678 min。在降解产物HPLC谱图中没有甘露糖的 峰，说明酶解产物几乎没有单糖。保留时间为6. 8M min的峰与甘露二糖（6. 822 min)相似，说明它是二 糖，以此类推其后4个峰分别是三糖、四糖、五糖和六 糖。因为降解产物已经用截留分子量为1〇〇〇 Da的超 滤膜分离过，七糖以上的组分已被截留，因此，只有六
糖以下的组分。
Emis等[9]和Shimahara等[1°]研究证明，片甘露聚 糖酶作用于魔芋胶或槐豆胶的作用位点是多糖链的非 还原端的第3或第4个糖分子。虽然不同来源的牙甘 露聚糖酶对底物的作用深度不同，但主要产物是甘露 低聚糖，相对来说，很少产生单糖。本研究的结果与其 相似。
3结论
用矛甘露聚糖酶酶解瓜尔胶制备了功能性低聚 糖——半乳甘露低聚糖。通过正交实验得到了在底物 浓度〇. 3%、50T：下的最佳酶解条件为：pH值7. 0、酶 解时间10 h、加酶量40 U • (g瓜尔胶厂1。在此条件 下进行酶解实验，经超滤分离，得到聚合度2〜10的产 品，产率为42.3%。通过MALDI-TOF质谱分析证 明，酶解液超滤之前的GMOS组分主要由2〜10个单 糖组成，但经过截留分子量为1000 Da的超滤膜处理 后，酶解液的组分主要由二糖、三糖、四糖、五糖、六糖 组成。通过13CNMR确定，本实验酶解产品是一种在 主链D■甘露糖基Cs上通过糖苷键连接1个半乳糖支 链的半乳甘露低聚糖，其结构与葡甘露低聚糖有所不同。