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酶法制备瓜尔胶半乳甘露低聚糖的研究

发布日期:2015-02-03 14:27:28
酶法制备瓜尔胶半乳甘露低聚糖的研究和甘露聚糖酶
酶法制备瓜尔胶半乳甘露低聚糖的研究
酶法制备瓜尔胶半乳甘露低聚糖的研究,以瓜尔胶为原料,采用,甘露聚糖酶酶法制备半乳甘 露低聚糖。通过单因素试验及L9(34)正史试验对酶解反应 条件进行优化和验证,结果表明,其最佳反应条件为:瓜尔 胶浓度〇• 5%,加酶責20 IU/g,pH 6. 0,50 °C,反应时间S h。 在此条件下,酶解率为24.2%,平均聚合度为4. 13。采用高 效液相色谱定性分析发现,酶解产物是以二糖为主要成分的 半乳甘露低聚糖。
聚糖和半乳葡甘露聚糖的主链内部随机切割卩甘露 糖苷键的水解酶,简称P-甘露聚糖酶(p-manminase)w ,广泛 存在于动植物和微生物中。据文献[3]报道,某些植物胶(如 魔芋胶、角ii胶、瓜尔豆胶、田菁胶等)经p•甘露聚糖酶水解 后的产物含有不同单糖分子组成的低聚糖。
半乳甘露低聚糖(galactomannan-o 丨 igosaccharides,简称 GMOS)是低聚糖家族的新成员,是半乳甘露聚糖的不完全 降解产物,它能显著增进人体肠道内以双歧杆菌为代表的有 益南的增殖,且具有减少动物肠道病原菌、增强免疫、提高肠 黏膜功能等多种特性目前,在日本已有以瓜儿胶为原 料制备的甘露低聚糖功能食品,但中国多是用魔芋胶制取葡 甘露低聚糖,而且对由瓜尔胶制备半乳甘露低聚糖的研 究较少。随着瓜尔豆在中国的推广种植[11],用瓜尔胶为原 料制备半乳甘露低聚糖将会具有重要的现实意义。本试验 采用甘露聚糖酶对瓜儿胶进行酶解,优化酶法制备半乳甘 露低聚糖的工艺条件,并对酶解产物进行定性检测,旨在为 产品的工业化生产提供参考。
1材料与方法
1.1材料与试剂
瓜尔胶:广东大地食用化工有限公司;
P-甘露聚糖酶:昆明爱科特生物科技有限公司;
甘露糖、甘露二糖:广州市齐云生物技术有限公司; 其他试剂均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
定时恒温磁力搅拌器:90-2型,上海沪西分析仪器有限 公司;
数字旋转黏度计:SNB4型,上海恒平科学仪器有限公司; 可见光分光光度计:JH 722S型,上海菁华科技仪器有 限公司;
高效液相色谱分析仪jhimadzu LC-20AT型,日本岛津 公司;
不差折光检测器:RII>l〇A型,日本岛津公司。
1.3检测方法
1.3.1 p■甘露聚糖酶活力的测定参照文献[12]。取0.5% 的瓜尔胶溶液(pH 5.0的磷酸氢二钠一柠橡酸缓冲液配置) 20 mL,加人0.1 mL用pH 5.0缓冲液配置的粗酶液,于 50X:反应30min,用DNS法测还原糖量。在上述试验条件 下,以每分钟水解底物产生1 /imol还原糖(以甘露糖计)所 需的酶量定义为一个P-甘露聚糖酶酶活单位(IU/gh 1.3.2黏度测定采用SNB—1数字旋转黏度计。
1.3.3瓜尔胶总糖测定准确称取0.05 g瓜尔胶置于 20 mL具塞试管内,酶法制备瓜尔胶半乳甘露低聚糖的研究,依次加人10 mL水和0.4 mL浓硫酸,于 100 t水解2 h,冷却后用NaOH中和,然后定容100 mL。 取1. 0 mL用DNS法测定还原糖(以甘露糖计)量,计算总糖 量,总糖含量按公式(1)计箅:
瓜尔胶总糖含量= =^^^^X100%(1)
1.3.4瓜尔胶酶解率不同浓度的瓜尔胶溶液中加人一定 活力单位的P-甘露聚糖酶(加酶量以IU/g瓜尔胶计),于不 同温度下反应一定时间,取样适当稀释后用DNS法测定酶 解液中的还原糖(以甘露糖计)量。酶解率按公式(2)计算:
瓜尔胶酶解率= U^^^X100%(2)
1.3.5平均聚合度(DP)聚合度为寡糖中组成寡糖的单 糖单位的个数[13]。半乳甘露低聚糖的DP按公式(3)计算:
平均聚合度(DP) =酶雜雜暈XI。。%(3)
1.3.6酶解产物高效液相色谱定性检测酶解液加入2倍 体积的无水乙醇,静置后离心,取上清液,浓缩,采用高效液 相色谱仪定性分析。色谱条件:色谱柱Kromasil 100-5NH2 (150X4.6 mm),柱温 40 X:,流速 1 mL/min,进样量 20 pL, 流动相为乙腈 > 水=70 : 30,示差折光检测器分析。
1.4试验方法
1.4.1单因素试验以酶解率和DP为指标,依次分别对加 酶量、底物浓度、酶解温度.pH值和反应时间进行单因素试 验。在0.5%的瓜尔胶溶液中分别加人10,15,20,25,30, 40 IU/g的p-甘露聚糖酶,于pH 5. 0,50 t:反应30 min,以确 定最佳加酶鼂;分别配置浓度为〇. 25%、0. 5%,1. 0%、 1,5%、2.0%的瓜尔胶溶液,各加入p-甘露聚糖酶20 IU/g, 于pH 5.0,50 1C反应30 min,以选择合适的底物浓度;在
0.5%的瓜尔胶溶液中加人20 IU/g p•甘露聚糖酶,分别在 pH 5.0,温度分别为 30,40,45,50,55,60,70,80 t:的条件下 反应30 min,以确定合适的反应温度;分别用pH 4. 0,5. 0, 6.0,7. 0,8. 0的缓冲液配置〇• 5%的瓜尔胶溶液,各加人 2〇 IU/g卩-甘露聚糖酶,于50 *C反应30 min,以选择最佳 PHUO. 5%的瓜尔胶溶液加人20 IU/g p-甘露聚糖酶, pH 5.0,50 t进行反应,在卜10 h内,每间隔1 h取样测定 酶解率,以确定合适的酶解反应时间。每个水平重复3次, 测定结果并取平均值。
1.4.2正交试验设计由于瓜尔胶酶解过程不仅受加酶 量、底物浓度、温度、时间、PH等因素影响,而且这些因素还 存在复杂的交互作用,故而设计L9(3<)正交试验,以确定酶 解瓜尔胶制备半乳甘露低聚糖的最佳条件。
2结果与分析
2.1甘露糖标准曲线的绘制
以甘露糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标做标准曲线 (见图1),得出回归方程为:y = 0.012 4 1—0.016,线性相 关系数记=0.998 6。
图1甘露糖标准曲线 Figure 1 Standard curve of mannose
2.2黏度测定
瓜尔胶酶解前后的黏度变化测定结果见表1。1%的瓜 尔胶黏度为4 294 MPa • s,加人一定量|3-甘露聚糖酶后,在 5 min后,黏度迅速下降,说明p-甘露聚糖酶能很好的降解瓜 尔胶。酶法制备瓜尔胶半乳甘露低聚糖的研究,可利用这种特性,通过补充底物的方式获得高浓度的 水解液。
表1酶解过程中瓜尔胶溶液的黏度变化
Table 1 The change of guar gum's viscosity
during hydrolysis
时间黏度AMPa. s-1)时间黏度AMFa • s M
0 min42942 h3. 334
5 min6. 6214 h2.944
10 min4. 7286 h2. 842
30 min3,5388 h2. 760
1 h3.371
2.3瓜尔胶总糖测定
0.05 g瓜尔胶被浓硫酸水解后中和定容至100 mL,取 lmL测定还原糖量。通过计算测得瓜尔胶总糖含董为 77.1%。
2.4酶解试验结果与分析
通过单因素试验,分别获得各因素的最佳试验结果,即 加酶M20 IU/g、瓜尔胶浓度0.5%、酶解温度456、
时间8 h。考虑到高浓度的瓜尔胶因为黏度过大而不利于酶 解反应的进行,故在单因素试验的基础上,固定瓜尔胶溶液。
浓度为03%,选择加酶量、酶解温度、酶解pH和时间4因 素设计正交试验,以确定酶解瓜尔胶制备半乳甘露低 聚糖的最佳条件。正交试验因素及水平见表2,正交试验结 果见表3„根据正交结果分析,PH对酶解率的影响最大,其 次是加酶M,反应时间和温度对酶解率率的影响相对较小。 酶法制备瓜尔胶半乳甘露低聚糖的研究,酶解的最佳条件为A2B3C2D2,即瓜尔胶浓度0.5%,加酶量 20 IU/g,pH 6.0,50 "C,反应时间8 h。由于此条件在正交 表中并未列人,故按此条件进行验证[14],测得其酶解率为 24. 2% ,平均聚合度为4.13,优于正交表中的试验值。
酶解产物商效液相色谱定性分析
分别取甘露糖和甘露二糖标准溶液以及酶解液进行髙 效液相色谱检测,结果见图2»
图2瓜尔肢酶解液高效液相色谱图
Figure 2 HPLC of guar gum hydrolysate
124
根据甘餺糖和甘霈二糖标准溶液的保留时间(分别是 3. 667和4. 234)分析,酶解产物中主要以二糖为主。
3结论
由于酶解反应可以在短时间内降低瓜尔胶的黏度,因此 在工业生产上,可以采用批量添加瓜尔胶的方式,从而获得 高浓度的水解液。在单因素试验基础上,通过正交试验确定 酶解制备半乳甘露低聚糖的最佳反应条件为瓜尔胶浓度 0.5%,加酶量20 IU/g,pH 6.0,50 *0,反应时间8 h•在此 条件下,酶解率为24. 2%,平均聚合度为4. 13。经HPLC定 性检测,瓜尔胶酶法制备的半乳甘露低聚糖以二糖为主。
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